qPCR 시험법
1. 개요
qPCR은 quantitative Polymerase chain reaction의 약자로, PCR로 얻는 DNA를 정량하는 방법이다.
PCR 과 비교하자면, PCR은 유전자에서 우리가 원하는 Target gene의 유무를 확인하고 복제하는 방법이라면, qPCR은 유전자에서의 Target gene 이 어느정도 발현하는지를 정량화 하는 방법이다.
우선 qPCR에는 크게 두가지 방법이 있다.
1)SYBR geen 을 이용한 Detection
2) Probe를 이용한 detection
두 방법에 대해 순서대로 이해해보자.
1) SYBR geen 을 이용한 Detection
SYBR green에 대해 우선 알아볼 필요가 있다.
SYBR green 은 dye 중 한 종류로 DNA 사이에 끼어드는 특징을 가지고 있다. 그래서 DNA Agarose gel 전기영동 이후 옛날에 많이 사용되었던 발암물질인 EtBr보다 안전한 대채제로 사용하기도 한다.
이런 특징을 사용해서 DNA 정량에 사용된다.
PCR이 진행될수록 DNA 2중 가닥의 양이 많아지게 되고, 이로 인해 SYBR green 이 DNA 사이에 더 많이 끼어들어가게 되면서 더 많은 형광을 내뿜게 되는 것이다. 이러한 특성을 이용해, 밝은 정도를 정량하여 우리가 확인하고자 하는 DNA양이 어느정도인지를 정량할 수 있게 되는 것이다.
여담으로 SYBR green 은 특허권이 있기 때문에 다른 회사들에서는 비슷한 기능을 하는 제품을 유사한 이름으로 출시하기도 한다. TAKARA 사의 TB green 이라던지, 바이오니아사의 Greenstar라던지...
2) Probe를 이용한 Detection
Taqman assay 라고도 불린다. 이 방법은 SYBR green 과 같은 형광 대신 Probe라는 양 끝에 형광이 달린 짧은 ssDNA 서열을 사용한다. 5' 쪽에 형광(Fluorescence)이 달리고, 3'쪽에 Quencher라는 것이 달린다.
이 prober가 유전자 복제가 이루어지면서 위 이미지처럼 유전자복제가 이루어지면서 probe에 붙어 있던 형광이 떨어지게되면서 빛을 발하게 된다.
즉 Target gene 이 복제가 많이 될수록, target gene 에 붙어있던 probe의 형광 결합이 끊어지면서 형광 세기가 세지며, SYBR green 과 비슷한 이유로 정량이 가능하다는 것을 알 수 있다.
하지만 SYBRgreen 과 비교하였을 때 Probe 가 추가됨으로써 모든 DNA 2중가닥에 끼어들어가는 SYBRgreen 과 다르게, 특정 sequence 에 붙기때문에 훨씬 더 높은 정확도를 가지게 된다.
최근 시험들은 모두 probe를 사용하는 추세라고 보아도 무방하다.
Probe 의 형광 발현 원리를 이해하려면 FRET 이라는 원리 조금 더 알 필요가 있다.
FRET 은 Fluorescence Resonance energy transfer의 약자로 두개의 형광 분자가 붙어있을 때 한쪽의 에너지가 다른쪽으로 이동하는 원리이다. 아래 그림을 자세히 살펴보자.
a 그림을 보면 파란 Donor가 에너지를 받고있다. 그렇게되면 donor가 형광을 방출하는 것이 맞지만, FRET 효과에 의해 옆에 있는 acceptor (probe에서는 quencher 되시겠다.) 가 그 에너지를 대신 받아 에너지를 발하게된다. 그래서 Donor는 에너지를 받음에도 Fluorescence 확인이 어려워지게 되는 것이다.
b 그림에서처럼 만약 FRET 효과가 없어진다면 donor의 형광 intensity가 증가하는 것을 볼 수 있다.
이런 FRET 원리로 probe를 사용하기에, probe design을 진행할 때 알맞은 Florescence를 선택해주는 것이 참 중요하다.
일반적으로는 6-FAM : TAMRA 조합이 제일 많이 사용된다.
하지만 Quencher 를 형광으로 사용하는 것은 background fluorescence를 증가시킨다는 단점이 있다.
형광은 한가지 파장이 아닌 넓은 스펙트럼 형태의 에너지를 분출하기 때문!
그래서 개발된 것이 Black hole quencher (BHQ) 라는 것이다.
BHQ는 형광이 아닌 소광제로 에너지를 받아 빛으로 발산하는것이 아닌 열로써 이를 방출한다.
따라서 Background 형광이 감소하게 되고, 좀 더 감도 높은 qPCR 시험이 가능하게 된다.
그렇다면 어떤 형광과 quencher를 이용해야 될까?
아래 표를 보면 아마 좀 더 수월한 design이 가능할 것이다.
2. 시험 방법
시험에 필요한 재료는 PCR과 거의 동일하다. Target 유전자와 Primer (+probe) 그리고 Polymerase이다.
Polymerase는 일반적인 PCR 그리고 qPCR 종류 (SYBR green, taqman) 에 따라서 성능차이가 있으므로 구매 전 용도에 맞는 polymerase 인지 꼭 확인하도록 하자.
Primer 및 Probe design도 다른 글로 좀 더 자세히 기술하도록 하겠다.
위 재료 말고 꼭 필요한것이 있다. 그것이 무엇이냐면 Standard 이다.
qPCR은 정량시험이지만 결과가 절대값을 바로 알려주지 않기에, qPCR을 통해 얻은 Standard를 이용한
형광 세기 그래프를 얻어야지만 실제 유전자 발현 양을 정량할 수 있게된다.
따라서 무조건 비교 혹은 기준이 될만한 유전자가 필요하며 이를 기준으로 분석을 진행해야 한다.
그렇다면 Standard로는 무엇을 사용할까?
가장 많이 사용하는 standard는 plasmid 이다.
Plasmid 의 경우 유전자 농도 측정도 가능하고, 유전자 g 당 발현하는 유전자 copy number를 수학적으로 계산할 수 있기 때문에 가장 많이쓰고 일반적이다.
계산식은 다음과 같다.
Copy No = X x 6.0221E+23 (molecules/mole) / (N x 660 g/mole)
X = DNA 의 양 (g)
N = DNA 길이 (nt)
6.0221E+23 = 아보가드로 수
660g/mole = 1bp dsDNA 평균 질량
예를 들어 100pg 의 pDNA 의 copy No 는 수식에 의해 약 1.7E+7 copy 가 된다.
우리가 원하는 A 라는 샘플의 B 유전자를 보고싶고, standard pDNA 에 B 유전자 서열이 있다면,
pDNA를 10배씩 log scale로 희석을 우선 진행한다. (1E+2, 1E+3, 1E+4 ... 1E+7 copy)
그 다음 A라는 sample을 standard와 qPCR 진행했을 때 샘플의 형광값을 standard의 형광값과 비교함으로
A 샘플 B 유전자의 copy no를 알수 있게되는 것이다.
데이터 분석과 관련해서는 따로 더 자세히 풀어보도록 하겠다.
qPCR 온도 설정방법은PCR과 거의 동일하다.
Denaturation 부터 Extension 까지는 PCR과 크게 다르지않다.
위 방법에서 조금 다른 부분은 Melting curve 라는 step이 추가된 것이다.
Melting curve는 Melting temperature (Tm) 값을 얻기 위함이다.
이는 Probe qPCR 방법에서는 사용되지 않고, SYBRgreen 을 이용한 방법에서만 주로 사용된다.
Probe의 경우에는 그만큼 정확도가 높아서 비특이적인 PCR 반응이 일어나기가 매우 힘들지만, SYBRgreen 을 이용하였을 때는 우리가 Target으로 지정하지 않은 유전자 외 다른 유전자가 같이 복제되면서 형광이 발현되거나 오염 등으로 인한 형광 발현이 있을 수 있기 때문이다.
따라서 Denaturation->Annealing->Denaturation 을 진행하면서 DNA 사슬이 끊어지는 온도 시점인 Tm 값을 파악하는것이다.
이 Tm 값은 DNA의 결합 세기 G=C, T=A 결합 비율, 유전자 길이에 따라 바뀌게된다. 만약 1개의 유전자 서열만 계속해서 복제가 되었다면 Melting curve를 확인하였을 때 1개의 peak만 확인이 되겠지만, 2개 혹은 그 이상의 유전자서열 혹은 불순물이 있다면 여러개의 melting curve를 확인하게 될 것이다.
qPCR을 진행하면서 단순 데이터만 확인하지 말고 다양한 요소들을 분석함으로써 데이터의 신뢰성을 꼭 확인하도록 하자.